کروماتوگرافی

برای انالیز پروتیینها و پپتیدها ابتدا باید انها را خالص کرد. برای تعیین توالی اسید امینه ای پروتیینها باید انها را بسیار خالص کرد. سلولها هزاران پروتیین گوناگون دارند که مقدار انها بسیار متفاوت است. لذا یکی از چالشهای اجتناب ناپذیر که ممکن است مستلزم بکار گیری متوالی چندین تکنیک تخلیص باشد جدا سازی یک پروتیین خاص به مقدار کافی برای انالیز است.در رویکردهای کلاسیک از تفاوتهای حلالیت نسبی پروتیینهای گوناگون به عنوان تابعی از PH (رسوب ایزو الکتریک) قطبیت (رسوب  با اتانول یا استن ) یا تغلیظ نمکی (خارج سازی بانمک سولفات امونیوم) استفاده میشود. در جداسازی کروماتوگرافی ملکولها بین 2 فاز متحرک و ثابت از هم جدا میشوند.فاز ثابت یا بستر برای جداسازی اسیدهای امینه یا قندها میتواند لایه ای از سلولز سیلیکا یا الومینا باشد (کروماتوگافی لایه نازک یا TLC)

کروماتوگرافی ستونی

در کروماتوگرافی ستونی پروتیینها برای فاز ثابت از یک ستون حاوی دانه های ریز کروی از جنس سیلیکا  اکریلامید یا سلولز تغییر یافته استفاده میشودکه سطح انها نوعا با گروههای شیمیایی فعال پوشیده شده است. این بسترهای فاز ثابت بسته بار هیدروفوبی و خواص اتصال به لیگاندشان با پروتیینها تعامل میکنند. مخلوط پروتیینی را به ستون می افزایند و فاز متحرک مایع را از ان می گذرانند.سپس فاز متحرک یا شوینده را کم کم از پایین ستون جمع اوری می کنند.

کروماتوگرافی تفکیکی

جداسازیهایی که با کروماتوگرافی ستونی انجام میشوند به میل ترکیبی نسبی پروتیینهای مختلف به یک فاز ثابت معین و یک فاز متحرک معین بستگی دارند. چسبیدن پروتیین به بستر(ماتریکس) ضعیف و گذراست. پروتیینهایی که تعامل قویتری بافاز ثابت دارند بیشتر نگه داشته میشوند.مدتی که هر پروتیین به فاز ثابت میچسبد تابعی از ترکیب هردو فاز ثابت و متحرک است . لذا با دستکاری ترکیب 2فاز میتوان جداسازی پروتیین مورد نظر از سایر پروتیینها را بهینه ساخت.

کروماتوگرافی غربالی

جداسازی پروتیینها با کروماتوگرافی غربالی یا فیلتراسیون روی ژل مبتنی است بر شعاع استوکس انها یعنی شعاع کره اشغالی انها هنگام پایین امدن با محلول. شعاع استوکس تابعی از جرم ملکولی و شکل است . پروتیین دراز در حال پایین امدن حجمی بیش از پروتیین کروی هم وزن خود دارد. در کروماتوگرافی غربالی از دانه های متخلخل استفاده میشود. این خلل و فرج مانند تو رفتگیهایی در ساحل رودخانه اند. تعدادی از ذرات هنگام حرکت رو به پایین وارد این تو رفتگیها میشوند. و لذا تا وقتی که به جریان اصلی باز گردند از بقیه عقب می مانند. به همین ترتیب پروتیینهایی که شعاع استوکس انها بزرگتر از ان است که وارد منافذ شوند(پروتیینهای رد شده) در جریان فاز متحرک می مانند و زودتر از پروتیینهایی که وارد منافذ میشوند (پروتیینهای پذیرفته شده) از ستون خارج میگردند. لذا پروتیینها به ترتیب شعاع استوکس خود از ستون فیلتراسیون روی ژل بیرون می ایند.

کروماتوگرافی جذبی

در کروماتوگرافی جذبی مخلوط پروتیینی را در شرایطی به ستون می افزایند که پروتیین مورد نظر بسیار سفت به فاز ثابت بچسبد و ضریب تفکیک عملا معادل 1 باشد. ملکلهایی که نمی چسبند ابتدا شسته و خارج میشوند. انگاه پروتیینها را با گسستن نیروهای پایدار کننده پروتیین- فاز ثابت یکی یکی ازاد میکنند. این کار را بیشتر با شیبی فزاینده از غلظت نمکی انجام میدهند. ترکیب فاز متحرک به تدریج تغییر میکند. به طوری که ملکلها به ترتیب نزولی میل ترکیبی خود به فاز ثابت به طور انتخابی ازاد می شوند.

کروماتوگرافی تبادل یونی

در کروماتو گرافی تبادل یونی پروتیینها با تعاملهای بار- بار به فاز ثابت می چسبند. پروتیینهایی که برایند بار انها در یک PH معین مثبت است به دانه هایی با گروههای فعال منفی مانند کربوکسیلات یا سولفات (تبادلگرهای کاتیونی) می چسبند. به همین ترتیب پروتیینهایی با برایند بارمنفی به دانه هایی با گروههای فعال مثبت  مانند امینهای نوع سوم و چهارم (تبادلگرهای انیونی ) می چسبند. پروتیینها پلی انیون هستند و لذا با یونهای تک ظرفیتی بر سر اتصال به ماده زمینه رقابت می کنند.(علت نامگذاری تبادل یونی).

مثلا پروتیینها جانشین یونهای مخالف (عموما CL و CH3COO)  در دی اتیل امینو اتیل(DEAE) سلولز می شوند تا بدان بپیوندند این یونهای مخالف امین پروتونه را خنثی کرده اند.پروتیینهای چسبیده را با افزایش تدریجی غلظت یونهای تک ظرفیتی در فاز متحرک به طور انتخابی ازاد می کنند. پروتیینها به ترتیب عکس قدرت تعاملشان  با فاز ثابت شسته و ازاد می شوند.

از انجا که برایند بار روی پروتیین به PH  بستگی دارد با تغییر PH فاز متحرک میتوان پروتیینها را یک به یک شست و خارج کرد. راه دیگر ان است که پروتینهارا 3 بار در معرض کروماتوگرافی تبادل یونی قرار دهند( در دو PH  متفاوت)  به طوری که پروتیینهایی را که در یک PH معین باهم شسته می شوند در PH دیگر تحت غلظتهای نمکی متفاوت دوباره بشویند.

کروماتو گرافی تعامل هیدروفوبی

کروماتوگرافی تعامل هیدروفوبی پروتیینها را بر اساس تمایلشان به بستر فاز ثابتی  که از گروههای هیدروفوبی پوشیده شده(مانند فنیل سفارز و اکتیل سفارز) از هم جدا می کند. پروتیینهایی که سطوح هیدروفوبی انها باز است از طریق تعاملهای هیدروفوبی که با قدرت یونی بالای فاز متحرک تقویت می شوند به بستر می چسبند. پروتیینهایی که نمی چسبند زودتر شسته می شوند. سپس قطبیت فاز متحرک را با کاهش تدریجی غلظت نمک کم می کنند. اگر تعامل میان پروتیین و فاز ثابت خیلی زیاد باشد می توان به فاز متحرک اتانول یا گلیسرول افزود تا قطبیت ان را کاهش دهد و تعاملهای هیدروفوبی را هرچه بیشتر تضعیف سازد.

کروماتوگرافی مبتنی بر میل ترکیبی

در کروماتوگرافی مبتنی بر میل ترکیبی از اختصاصی بودن زیاد اکثر پروتیینها برای لیگاندهایشان استفاده می شود. برای تخلیص انزیمها با کروماتوگرافی مبتنی برمیل ترکیبی می توان از سوبستراها محصولات کو انزیمها  یا بازدارنده های انها که تثبیت شده اند استفاده کرد.از نظر تئوری فقط پروتیینهایی می چسبند که با لیگاند تثبیت شده تعامل میکنند. انگاه پروتیین چسبیده را با عمل رقابتی لیگاند محلول یا به طوری غیر اختصاصی تر با گسستن تعاملهای پروتیین- لیگاند به کمک اوره گوانیدین  هیدروکلرید PH مختصر اسیدی یا غلظت بالای نمک می شویند.بسترهای تجاری فاز ثابت حاوی لیگاندهایی همچون انالوگهای NAD و ATP  هستند. ازجمله قویترین بسترهای مبتنی بر میل ترکیبی که کاربرد گسترده ایی دارند می توان به انهایی اشاره کرد که برای تخلیص پروتیینهای نو ترکیب  تغییر یافته ساخته می شوند. از جمله انها بستر  Ni2+ است که به پروتیینهای واجد (گوشواره) پلی هیستیدینی متصل می شود و نیز بستر گلوتاتیونی که به پروتیینهای نو ترکیب متصل به گلوتاتیون S- ترانسفراز می چسبد.پپتیدها را با HPLC فاز معکوس خالص می کنند

بسترهای فاز ثابت که در کروماتوگرافیهای ستونی کلاسیک به کار می روند موادی اسفنجی هستند که فشرده پذیری انها جریان فاز متحرک را محدود می سازد. در کروماتوگرافی با مایع پرفشار (HPLC) از دانه های ریز و غیر قابل فشردن سیلیکا یا الومینا به عنوان فاز ثابت استفاده می کنند و فشار را تا چند هزار Psi  بالا می برند. بسترهای غیر قابل فشردن امکان هم سرعت بالای جریان و هم تفکیک بسیار دقیق را فراهم می سازند. HPLC  می تواند مخلوطهای پیچیده لیپیدی یا پپتیدی را که خواص انها تنها اندکی باهم فرق دارد از هم جدا کند. در HPLC  فاز معکوس از پلیمرهای خطی 13-18 کربنی به عنوان فاز ثابت هیدروفوبی استفاده می شود. مخلوطهای پپتیدی را به کمک شیبی از حلال الی قابل اختلاط با اب مانند استونیتریل یا متانول می شویند.

Harper. Harold Anthony